丁香有效期的研究
2018-04-08 11:40
在众多的中药(中药材及中药饮片)中，有的稳定性相对较差，如贮存不当而易走油、变色。如颜色变深、变浅或走油都说明某些化学成分发生了变化，质量已经改变。这类中药的合理贮存是保证其品质的关键。因此，进行此类中药的有效期研究，科学预测有效期对保证中药质量、人民用药安全具有重要意义。然而标明及研究中药有效期的报道还不多见，只有菊花、苦杏仁有类似报道。
丁香为桃金娘科植物丁香Eugenia caryophyLLata Thunb.的干燥花蕾，主要有效成分为丁香酚挥发油类，另外还含黄酮类化合物等。丁香为易走油、变色或气味易散失、不耐贮存的中药，我们以丁香酚为指标，通过经典恒温加速和留样观察实验[8]，测定各温度各时间段丁香酚的含量，推算出贮存温度下的速度常数，从而计算出丁香的有效期。
1 仪器与材料
1.1 仪器
HPLC色谱仪：AgiLent1100系列四元梯度泵、AgiLent1100手动进样器、AgiLent1100系列二极管阵列检测器、AgiLent1100工作站；超声波清洗器（昆山市淀山湖检测仪器厂）；万分之一电子分析天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。
1.2 试药 甲醇（色谱纯）；注射用水；其余所用试剂均为分析纯。丁香经本院药品质检室副主任药师周新蓓鉴定为《中国《中国药典》》收载品种，批号20020910。丁香酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号0736-9909，含量测定用）。
2 方法与结果
2.1 丁香酚含量测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱：KromasiL C18 5μm ф4.6×200mm；流动相：甲醇-水(45:55)；波长:270nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min。在此条件下保留21.2min左右。HPLC图见图1~2。
2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品9.96mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（0.3984mg/mL）。
2.1.3 供试品溶液制备 取供试品粗粉（过二号筛）约0.1g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加甲醇50mL，称定，超声处理30min，放冷，再称定，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.4 线性范围考察 精密吸取丁香酚对照品溶液1、2、3、4、5μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵座标、进样量为横坐标进行线性回归：Y=491.0524X-24.2775；r=0.9995，说明丁香酚在0.3984～1.992μg有良好的线性关系。
2.1.5 稳定性试验 分别精密吸取供试品溶液5μL，于0、1、2、4、8、24h进样测定。结果RSD=1.77%。
2.1.6 精密度试验 取对照品溶液4μL进样，连续5次，结果RSD=1.62%。
2.1.7 重现性试验 取供试品溶液5份，按上述色谱条件测定，结果RSD=1.97％。
2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的供试品粗粉约0.04g，共6份，精密称定，各精密加入浓度为3.5mg/mL的对照品溶液适量，分别按2.1.3制得供试液，在上述色谱条件条件下测定丁香酚含量，结果见表1。
表1 丁香酚线性范围考察
|
进样/μL |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
峰面积 |
171.5891 |
377.0610 |
547.6359 |
747.1179 |
959.7361 |
2.2 经典恒温实验
2.2.1 样品制备 分别取供试品约50g，共48份，用普通塑袋(熔点在120℃左右[9])包装封口。置电热恒温箱中，分别选择4个温度与间隔时间70℃10、20、30、40h；60℃20、40、60、80h；50℃、40、80、120、160h；40℃80、160、240、320h，取出，粉成粗粉备用。
2.2.2 水量测定 照《中国药典》附录Ⅸ H甲苯法，取供试品粉末20g，精密称定，加无水甲苯200mL，回流至上层液体清亮，读取水的体积，计算含水量。
2.2.3 丁香酚含量测定 取丁香粗粉约0.1g，按2.1.3法操作，进样5μL，结果见表2。
表2 丁香经典恒温实验结果及丁香酚含量变化与时间的关系
|
T/℃ |
取样时间/h |
取样量/g |
含水量% |
丁 香 酚 |
||||
|
峰面积 |
均含量% |
相对浓度C% |
对数浓度LogC |
回归结果 |
||||
|
18.5 |
初始 |
0.08624 |
10.30 |
561.7917 |
13.839 |
100 |
2.0000 |
|
|
40 |
80 |
0.10705 |
9.50 |
686.6902 |
13.525 |
96.82 |
1.986 |
r=-0.9975 a=1.999 b=-1.65×10-4 |
|
160 |
0.14625 |
9.00 |
916.8750 |
13.105 |
93.32 |
1.970 |
||
|
240 |
0.11505 |
8.80 |
700.8544 |
12.835 |
91.20 |
1.960 |
||
|
320 |
0.12705 |
8.50 |
754.9134 |
12.490 |
88.51 |
1.947 |
||
|
50 |
40 |
0.10925 |
10.00 |
674.4913 |
13.025 |
93.76 |
1.972 |
r=-0.9998 a=1.999 b=-6.825×10-4 |
|
80 |
0.12195 |
9.60 |
713.0738 |
12.310 |
88.31 |
1.946 |
||
|
120 |
0.15350 |
9.10 |
849.3661 |
11.590 |
82.60 |
1.917 |
||
|
160 |
0.17190 |
8.70 |
900.4152 |
10.955 |
77.80 |
1.891 |
||
|
60 |
20 |
0.11195 |
9.90 |
657.1486 |
12.395 |
89.12 |
1.950 |
r=-0.9996 a=1.998 b=-2.37×10-3 |
|
40 |
0.14725 |
9.60 |
777.7403 |
11.095 |
79.62 |
1.901 |
||
|
60 |
0.12080 |
9.30 |
568.9551 |
10.000 |
71.45 |
1.854 |
||
|
80 |
0.13640 |
8.90 |
613.2369 |
9.518 |
67.71 |
1.811 |
||
|
70 |
10 |
0.09868 |
9.40 |
472.4043 |
10.250 |
73.30 |
1.865 |
r=-0.9967 a=1.988 b=-1.012×10-2 |
当对数浓度与时间呈线性相关时，即LogC＝-kt/2.303+LogCo，为一级反应。根据b值求出各温度下的速度常数k值。然后根据Arrhenius公式，计算出贮存条件下的速度常数k。结果见表3。
表3 丁香酚含量变化速度常数与温度的关系
|
T/℃ |
1/T×103 |
k/h |
Logk |
回归结果 |
|
40 |
3.195 |
3.800×10-4 |
-3.420 |
r=-0.9991 a=16.77 b=-6.323 |
|
50 |
3.096 |
1.570×10-3 |
-2.804 |
|
|
60 |
3.003 |
5.458×10-3 |
-2.263 |
|
|
70 |
2.915 |
2.331×10-2 |
-1.632 |
LogK对1/T进行回归，求出回归方程：Logk＝-Ea/(2.303RT)+LogA
Ea为活化能，R为摩尔气体常数8.314，A为频率因子。
《中国药典》规定丁香置阴凉处（不超过20℃）贮存。当温度为20℃时，K20℃=1.557×10-5，丁香酚下降10%所需的时间t＝0.1054/k＝282天，丁香酚下降至《中国药典》规定的最低浓度11.0%，所需的时间为905.8d，即本批产品的有效期为900d。
2.2.4 留样观察 取供试品50g，用普通塑袋包装封口，置恒温箱中20℃保存，分别于1、2、3、6、12、24个月后测定样品的含水量和丁香酚含量（取其粗粉约0.1g，按2.2.3法操作）。留样观察结果与根据速度常数计算出丁香酚含量，结果见表4。
表4 丁香留样观察实验结果n=3
|
t/月 |
取样量/g |
含水量% |
丁香酚 |
|||
|
峰面积 |
均含量% |
干燥品含量% |
经典实验推算值% |
|||
|
0 |
0.08624 |
10.3 |
561.7917 |
13.84 |
15.43 |
15.43 |
|
1 |
0.09572 |
10.3 |
620.1410 |
13.71 |
15.28 |
15.26 |
|
2 |
0.1192 |
10.4 |
765.9240 |
13.50 |
15.07 |
15.09 |
|
3 |
0.1188 |
10.4 |
753.3550 |
13.33 |
14.88 |
14.92 |
|
6 |
0.1177 |
10.5 |
717.2563 |
12.83 |
14.34 |
14.43 |
|
12 |
0.1065 |
10.9 |
598.5807 |
11.91 |
13.38 |
13.49 |
|
24 |
0.1016 |
10.6 |
494.0892 |
10.39 |
11.62 |
11.69 |
3 小结
3.1 丁香的初始、恒温实验和留样观察后的部分性状描述 本品为干燥花蕾，棕褐色至褐黄色；质坚实，富油性；气芳香浓烈，味辛辣、有麻舌感。经典恒温实验和留样观察后，仍为棕褐色，表面光泽变化不大，70℃40h和60℃80h表面约显干燥。随温度升高或时间延长，气味变化较明显，不及温度低和时间短的香气浓烈。留样观察2年，外表显油样，色泽加深，棕褐色。
3.2 丁香酚测定方法的分析 丁香酚是丁香的主要成分，具有挥发的特点，《中国药典》用气相色谱法测定含量；实验用HPLC，适合丁香酚易挥发、对热不稳定的特性，在保证不影响丁香酚含量时，能与丁香中其它成分获得良好分离。通过方法学考察，证明该法准确、可靠，条件比气相色谱易于掌握。
3.3 经典恒温与留样观察实验结果的分析 丁香于20℃贮存，其速度常数为K20℃=1.557×10-5，经留样观察验证，计算的结果与0～24月丁香酚实际测量值基本相近，说明丁香在20℃贮存，丁香酚的含量变化符合一级反应规律，所得速度常数K20℃=1.557×10-5比较可靠。
3.4 含水量结果分析 《中国药典》2000年版及2005年版均未规定丁香的含水量，根据相关文献“饮片含水量应控制在8%～12%为宜”，本次恒温与留样观察实验该品的水分含量在8.5%～10.5%。
4 易走油、变色和气味易散失的中药贮存讨论
防止中药易走油变质，应采取降温和适当的干燥（降低内含水分），并注意以下几方面问题。
4.1 防挤压 含大量油脂的中药，在贮藏或运输中，避免挤压。
4.2 干燥方法及注意事项 干燥降低内含水分，一般在产区晒干，入库后注意检查，最好在梅雨季节前晒一次。如受潮，不宜火烤、烈日曝晒及空气潮湿时通风，只能在干燥的空气中阴干、敞开摊晾、晾晒或堆码成通风垛散潮；少量者可入石灰缸。
4.3 盛装容器 最好采用陶瓷缸、坛或瓮，在容器四周衬以草纸(或灰纸类)，将明矾（或水飞滑石）0.5kg分成4份，布包，放在药中间，盖严容器，以防泄气；凡易走油（除带壳的外）中药，忌用铁器存放，以免走油后产生铁锈而污染。大量存放或外运时，最好用木箱（内衬防潮油纸或塑袋）包装。
4.4 存放场所 阴凉干燥，若条件较差，可贮藏在地下室（因湿度较大，注意防潮）、窑洞等，以防受热。贮藏期不宜过久，应遵循“先进先出”的进出货原则。
5 实验研究中出现与待解决的问题
5.1 把握质量关 选择完整、个大、油性足，颜色深红、香气浓郁、入水下沉者为佳。
5.2 阴凉真空密封贮存 丁香在《中国药典》规定的贮存条件下，如再加上真空密封，则保存的时间更长。
5.3 丁香酚不同含量的丁香有效期 《中国药典》规定含丁香酚不得少于11.0%(即= t0.9时的含量)，根据回归方程，计算出丁香酚含量为12％ ，13％ ，14％ ，15％ ，16％ ，17％ 的丁香有效期依次为232，447，545，830，1002，1165d。建议中药生产企业在中药包装袋上标明生产时间和有效成分的含量，便于商家和使用单位推算其有效期。
（张志国,曹臣,欧阳荣,黄大香,周新蓓,葛亮. 丁香有效期的研究[J]. 中国现代中药,2007,(11):19-22.